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組織観察・アニリンブルー染色
柱頭・花柱・子房内における花粉管の観察
Date
2024年5月29日
Uploaded by
Reference
Nakano, Arisa
Hoshino, Y, Murata, N, Shinoda, K. (2006). Isolation of individual egg cells and zygotes in Alstroemeria followed by manual selection with a microcapillary-connected micropump. Annals of Botany, 97(6): 1139-1144. https://doi.org/10.1093/aob/mcl072
Materials and Methods
星野先生の資料「アニリンブルーによる柱頭・花柱・子房内における花粉管の観察」
方法
1. 受粉後の子房をファーマー液*（酢酸：EtOH＝1:3）で24時間固定する *用事調整。サンプルの体積の20倍以上になるように調整する
2. 子房を70% EtOHに置換し、冷蔵保存（4℃）する
3. ウォーターバスを60℃に設定する
4. 別のサンプル管に、サンプルとサンプルが浸る程度の1N NaOH溶液を入れる
5. サンプル管を60℃のウォーターバスに浮かべ、10-15分間*処理し、加水分解する
*押し潰したときの様子で時間を調整する
組織観察の場合
6a. 氷水を入れたスチロール容器（カルックス）にサンプル管を移し、反応停止する
7a. 1N NaOH溶液をスポイトで除き、DWに置換する
※1N NaOH溶液は大量の水と共にシンクに流す
アニリンブルー染色の場合
6b. 加水分解後、10分毎にDWで3回すすぐ
7b. アニリンブルー溶液*で一晩以上染色する
*アニリンブルー溶液の調整方法 1）0.7076 g リン酸三カリウム（K3PO4）を100 mL DWに溶解する 2）溶液に0.1 gアニリンブルー（水溶性）を添加する 濃紫色から透き通った茶褐色になる（2-3時間程度混合する） 3）濾過する（必ずしも必要ではない可能性がある） 4）褐色瓶あるいはアルミ箔で覆ったチューブに入れ、冷蔵保存する |
以降、共通
8. スライドグラスを消毒用EtOHでふき取り、その上に処理後サンプルを置く
9. 押し潰す前のサンプルを確認し、顕微鏡下で撮影・記録する
10. サンプルに50％グリセリン（DW: グリセリン=1:1）を滴下し、カバーガラスの上から押し潰した後*、顕微鏡下で観察を行う
*花柱の観察時には、花柱が折り曲がらないように注意する